行銷人5.3-國偉

《CRISPR-Cas12b》效應器

V型CRISPR效應器Cas12b（以前稱為C2c1）在人類細胞中進行基因組編輯方面面臨著挑戰 ，至少部分是由於已鑑定家族成員的高溫需求。
在這裡，我們探討了Cas12b家族的多樣性，並從組生芽孢桿菌BhCas12b中鑑定了人類基因編輯的有前途的候選者。
但是，在37°C時，野生型BhCas12b優先形成非靶DNA鏈的切口，而不是形成雙鏈斷裂，從而導致較低的編輯效率。

使用組合的方法，我們確定BhCas12b的功能獲得突變可以克服此限制。
突變BhCas12b促進了人類細胞系和離體細胞的強大基因組編輯與原發性鏈球菌Cas9相比，它在原代人類T細胞中具有更高的特異性。
這項工作建立了第三個RNA指導的核酸酶平台，除了Cas9和Cpf1/Cas12a，用於人類細胞中的基因組編輯。

從群集的原核，定期間隔開短回文重複序列和CRISPR相關蛋白（CRISPR-CAS）系統酶已被利用作為可重新編程和高度特異性的基因組編輯工具。當前的基因組編輯技術專注於2類CRISPR–Cas系統，該系統包含用於DNA切割的單蛋白效應子核酸酶。

然而，只有兩個家庭類2核酸酶已被利用，用於在人細胞中對日期的基因組編輯：Cas9，雙RNA引導的核酸既要有CRISPR RNA（crRNA）和tracrRNA5和同時包含HNH和RuvC核酸酶結構域，和Cas12a，一種僅需crRNA且包含單個RuvC結構域的單RNA指導的核酸酶。
在這裡，我們著重於第三家庭類2效應，Cas12b，雙RNA引導的核酸酶包含單個RuvC域和需要同時crRNA和tracrRNAs。

儘管Cas12b蛋白通常小於Cas9和Cas12a，因此從通過病毒載體進行細胞內遞送的角度來看具有吸引力，但表徵最強的酸酸脂環酸桿菌（AacCas12b）的Cas12b核酸酶在48°C時表現出最佳的DNA裂解活性，從而排除了其在哺乳動物細胞中的使用。

我們試圖確定在較低溫度下有活性的Cas12b家族成員，因此可以適合人類基因組編輯。

鑑定中溫Cas12b核酸酶。
位點示意圖和蛋白質域結構突出顯示了Cas9，Cas12a和Cas12b核酸酶之間的差異。

SpCas9（PDB：4oo8 [10.2210 / pdb4OO8 / pdb]），AsCas12a（PDB：5b43 [10.2210 / pdb4OO8 / pdb]）和AacCas12b（PDB：5u30 [10.2210 / pdb5U30 / pdb]）的晶體結構。

b用純化的Cas12b蛋白和通過RNA-Seq鑑定的合成crRNA和tracrRNA在體外重建Cas12b系統。
反應在指定的溫度下進行90分鐘，並添加250 nM Cas12b蛋白。

c，d具有六個sgRNA變體的293T細胞中的AkCas12b和BhCas12b indel活性。

誤差棒表示來自n=4個重複的sd。見補充圖3b，c用於sgRNA序列。

e BhCas12b sgRNA設計1的示意圖，灰色陰影突出了指南設計更改的位置（有關指南設計變體2–6的確切序列，請參見補充圖  3）。

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